DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA A2

Fundamento

En esta determinación, después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retinas por una resina de intercambio aiónico.

Tras ello, la hemoglobina A2 se eluye de una forma específica, bajo estrictas condiciones de pH y fuerza iónica.

Finalmente, la hemoglobina A2 se cuantifica mediante lectura espectrofotométrica a 415 nm.

Material necesario

·         Tubos de recogida de sangre que contengan heparina o EDTA como anticoagulante.

·         Pipetas Pasteur.

·         Pipetas graduadas de 2,5 y 10 ml.

·         Una prepipeta o pera de aspiración.

·         Micropipeta automáticas capaces de dispensar 50, 100 y 200 µl.

·         Puntas de micropipeta (amarillas).

·         Un rotulador de vidrio.

·         Tubos de ensayo.

·         Una gradilla.

·         Un espectrofotómetro ajustable a 415nm.

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·         Cubetas de espectrofotómetro.

·         Papel y un bolígrafo.

Reactivos

·         Agua destilada o desionizada.

·         Reactivo 1.

Es trión X-100 a una concentración del 0,5%.

Se utiliza como hemolizante.

·          Reactivo 2.

Es un tampón tris-HCI a una concentración de 35 mmol/1 y un Ph de 8,2.

Se usa para eluir la hemoglobina A2.

·         Microcolumnas.

Contiene una resina de intercambio aniónico equilibrada.

En ella quedan retenidas las hemoglobinas.

Todos los reactivos deben almacenarse a temperatura ambiente (15-30 ⁰C).

Muestra

Sangre completa, anticoagulada con EDTA o con heparina y obtenida recientemente ( también  puede emplearse sangre almacenada a 2-8 ⁰ C durante una semana como máximo).

A partir de la sangre problema se ha de preparar un hemolizado que contenga la Hb libre en solución. Este hemolizado se prepara de la siguiente forma:

1.       Pipetear un tubo de ensayo 50 µl de sangre y 200µl de reactivo 1.

2.       Agitar bien.

Este hemolizado se utilizará en la separación y lectura de la Hb A2.

A partir del hemolizado anterior se debe preparar una dilución que contenga la Hb a una concentración menor. Esta dilución del hemolizado se prepara de la siguiente manera:

1.       Pipetear en un tubo de ensayo 50 µl de hemolizado y 12 ml de agua destilada.

2.       Agitar bien.

Esta dilución del hemolizado se empleará en la lectura de la Hb total.

Técnica

1.       Invertir alguna vez la columna para hacer descender cualquier resto de retina del tapón.

2.       Destapar la parte superior de la columna.

3.       Resuspender la resina, utilizando una pipeta Pasteur y procurando que no se formen burbujas al hacerlo.

4.       Colocar la columna sobre un tubo de ensayo.

5.       Quitar el tapón inferior.

6.       Esperar a que vuelvan a sedimentarse la resina

7.       Desechar el eluido generando en el proceso anterior.

8.       Sin alterar el lecho de la resina, aplicar cuidadosamente sobre ella 50 µl de hemolizado.

9.       Desechar el eluido.

10.   Cuando haya penetrado todo el hemolizado y procurando arrastrar los posibles restos del mismo, añadir 100 µl de reactivo 2.

11.   Desechar el eluido.

12.   Colocar la columna sobre un tubo de ensayo nuevo.

13.   Añadir 5 ml de reactivo 2.

14.   Recoger el eluido (fracción de Hb A2).

15.   Agitar bien la fracción de Hb A2.

16.   Leer, a 415 mm y frente a agua destilada, la absorbancia de la fracción de Hb A2 (AHbA2)

17.   Agitar bien la dilución del hemolizado, preparada previamente y que contiene todo la Hb.

18.   Leer, a 415 mm y frente agua destilada, la absorbancia de la Hb total (AHbT).

Hoja de Trabajo

1.       ¿Qué tipo de cromatografía se realiza en esta determinación?

En dos fases, móvil y fija

2.       ¿Con qué producto está hecha la columna?

3.       ¿Con qué se hemoliza la sangre? trión X-100 a una concentración del 0,5%.

4.       ¿A qué longitud de onda se ajusta el espectrofotómetro? 415 nm

¿Qué hemoglobinas anómalas son eluias justo con la Hb A2? Hb C, Hb kolon