ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS

Fundamento

La carga eléctrica global de las hemoglobinas es la resultante de la suma de las cargas de los aminoácidos que contribuyen las cadenas polipeptídicas de su globina.

 En la electroforesis de hemoglobinas, el hemolizado se deposita sobre un soporte empapado en un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa.

Material necesario

·         Una gradilla.

·         Tubos de centrifuga.

·         Pipetas Pasteur.

·         Pipetas graduadas de 0,5, 1, 2 y 5 ml

·         Una centrífuga

·         Un espectrofotómetro

·         Cubetas de espectrofotómetro

·         Un vidrio de reloj

·         Bateas

·         Pinzas

·         Papel de filtro

·         Probetas de 100 ml de capacidad

·         Una placa de vidrio de unos 18 x 18 cm

·         Una estufa

·         Un reloj              

·         Una fuente de alimentación

·         Una cubeta: es el recipiente donde se lleva a cabo la electroforesis.

·         Un puente: en él se sitúan las tiras soporte para que estén horizontales y con sus extremos en contacto con un tampón.

·         Un aplicador: se utiliza para depositar la muestra sobre las tiras soporte.

·         Medio de soporte: es el medio físico en el cual migran las proteínas.

Hay dos tipos principales: los que permiten la separación molecular en base a su carga eléctrica neta y las que hacen posible la separación en base a la carga y al tamaño molecular.

http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Genenzima/ELECTRO1.BMP

Reactivos

·         Suero fisiológico (solución de cloruro sódico al 0,9%).

·         Agua destilada o desionizada.

·         Cloroformo o triclorometano (CI3CH).

·         Tampón: es el líquido que ioniza las proteínas.

·         Colorante: Rojo Ponceau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g.

Ácido tricloroacético al 5%  . . . . . . . . . . . 100 ml

·         Decolorante: elimina el exceso de colorante que tiñe las tiras.

·         Deshidratante: alcohol metílico (metanol).

·         Solución trasparentadora

Muestra

·         Hemolizado preparado de la siguiente manera:

Técnica

1.       Sumergir las tiras en tampón durante 10 minutos como mínimo.

2.       Absorber el exceso de tampón de las tiras, situándolas entre dos hojas de papel filtro.

3.       Montar las tiras sobre el puente, de forma que quedan dispuestas con su casa absorbente (mate) hacia arriba. Para estar seguros de esto, la esquina cortada de las tiras siempre debe estar cercana al analista y hacia su lado derecho.

4.       Verter en el interior de la cubeta la cantidad de tampón suficiente para que los electrodos queden cubiertos.

5.       Introducir el puente con las tiras, en el interior de la cubeta, de forma que los extremos de éstas queden sumergidos en el tampón.

6.       Depositar un poco de la dilución del hemolizado en el interior de un vidrio de reloj y tocarla, suavemente, con el extremo ranurado del aplicador para cargarlo con ella.

7.       Situar la dilución del hemolizado, mediante el aplicador previamente cargado, sobre el extremo catódico de cada una de las tiras y, aproximadamente, a 1,5 cm de su borde libre.

Se considera extremo catódico de la tira al extremo de esta que está más cercano al cátodo. Este electrodo suele corresponderse con la entrada negra de la cubeta.

8.       Conectar la cubeta al alimentador, usando un cable negro para la entrada de la cubeta y la salida del alimentador de color negro, y otro rojo para la salida de la cubeta y la entrada del alimentador de  color rojo.

De esta manera se hace atravesar la corriente eléctrica desde el extremo catódico de las tiras hasta su extremo anódico.

9.       Encender la fuente de alimentación y aplicar sobre las tiras una corriente eléctrica de 200 voltios, durante 90 minutos.

10.   Transcurrido ese tiempo, apagar el alimentador y desconectarlo de la cubeta.

11.   Sumergir las tiras, con su cara absorbente hacia abajo, en el colorante elegido, durante unos 10 minutos.

12.   Decolorar las tiras, mediante baños sucesivos de las mismas en el decolorante apropiado, hasta  que se vean claramente las bandas de hemoglobina y el fondo sea blanco.

   http://bioquimed.wikispaces.com/file/view/electroforesis.png/237453821/544x399/electroforesis.png

Hoja de Trabajo

1.       ¿De qué material son las tiras empleadas en esta técnica?

2.       ¿Cuál es el decolorante del rojo Ponceau?

3.       ¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable?

4.       ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforética de Hb S?

                              ¿Cuál es la Hb normal más electronegativa?