DETERMINACIÓN FUNCIONAL DEL FIBRINÓGENO 9/3/2015

Fundamento

La determinación cronométrica de fibrinógeno se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina de degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coágulo.

El tiempo que tarda en originarse el coágulo de fibrina depende, exclusivamente, de la cantidad inicial de fibrinógeno y es inversamente proporcional a la concentración de éste en el plasma estudiado (fibrinogenemia).

Material necesario

http://www.coagulation-analyzers.com/photo/pl518153-fib_kit_for_quantitative_determination_of_fibrinogen_kit.jpg

·         Una gradilla.

·         8 tubos de ensayo de plástico.

·         Una prepipeta de seguridad.

·         Una pipeta graduada de vidrio de 1ml (1.000 µl) y otra de 2ml (2.000 µl) de capacidad.

·         Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.

·         9 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).

·         Un rotulado de vidrio de punta fina.

·         7 cubetas de coagulómetro.

·         7 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.

·         Un coagulómetro.

·         Un bolígrafo.

·         Una hoja de papel de tipo logarítmico-logarítmico.

Reactivos

·         Un Fibrinogène-Kit de los laboratorios bioMérieux. Este Kit contiene 2 reactivos.

-Reactivo 1: es trombina bovina a una  concentración de 100 U NIH/ml.

-Reactivo 2: es tampón veronal a pH 7,35.

También se puede emplear la trombina bovina elaborada por cualquier otro laboratorio comercial  y un tampón imidazol.

·         Un plasma calibrador o de referencia: es un plasma cuya concentración de fibrinógeno es conocida.

·         Agua destilada.

Muestra

·         Un plasma pobre en plaquetas (PPP), correctamente preparado.

Técnica

1.       Homogeneizar los reactivos, sin agitarlo bruscamente.

2.       Diluir el plasma calibrador y la muestra, de la manera que se indica en el siguiente cuadro:

Plasma calibrado (en µl)	100	100	100	100	100	100	100
Muestra (en µl)	0	0	0	0	0	0	100
Tampón veronal (en µl)	400	900	1.400	1.900	2.400	2.900	900
Dilución	1/5	1/10	1/15	1/20	1/25	1/30	1/10
Fibrinogenemia	Cx2	C	C/1,5	C/2	C/2,5	C/3	¿

C = concentración del fibrinógeno en el plasma calibrador.

3.       Depositar el volumen total de trombina bovina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.

4.       Atemperar la trombina bovina a temperatura ambiente (20-25°C). Si se utiliza la trombina de los laboratorios torios Pacific Hemostasis, hay que atemperarla a 37°C.

5.       Introducir un trocito de acero apropiado en 7 cubetas de coagulómetro.

6.       Rotular el extremo superior de 6 cubetas con las concentraciones: Cx2, C, C/1,5, C/2, C/2,5 y C/3; y el de otra cubeta con la letra M (de Muestra).

7.       Verter 200 µl de cada una de las diluciones del plasma calibrador y de la muestra en sus cubetas correspondientes.

8.       Incubar las diluciones del plasma calibrador y la muestra, contenidas en las cubetas, a 37°C, durante 2 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.

9.       Colocar, sucesivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 100 µl de trombina bovina.

Al agregar la trombina, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo trascurrido desde la adición de la trombina.

Hoja de Trabajo

1.       ¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica? Determinación cronométrica

2.       ¿A qué concentración está la trombina bovina? Al 100 %

3.       ¿A qué dilución se somete a la muestra? Dilución 1/5

4.       ¿Cuál es la fibrinogenemia normal? Entre los 150 y 450 mg/dl