PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA.  6/3/2015

Material necesario

·         8 tubos de ensayo de plástico.

·         Un rotulador de vidrio de punta fina.

·         Una prepipeta de seguridad.

·         Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1.000 µl) de capacidad de dispensión.

·         Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.

·         7 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).

·         5 cubetas de coagulómetro.

·         5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.

·         Un coagulómetro.

·         Un baño de agua ajustable a 37°C.

·         Un bolígrafo.

·         Una regla.

·         Una hoja de papel milimetrado. También se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).

·         Una gradilla.

Reactivos

·         Solución salina al 0,85% o, mejor aún, tampón de Michaelis.

·         Una tromboplastina cálcica (por ejemplo, el reactivo Thromboplasatin-D preparado por los Laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la Casa comercial RAL).

·         Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los Laboratorios Pacific Hemostasis).

A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85% o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	½	1/3	¼	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asignado a cada dilución.

Técnica

1.       Homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.

2.       Depositar el volumen total del tromboplastina cálcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.

3.       Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37°C. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37°C, entre 5 y 15 minutos.

4.       Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.

5.       Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50. El de otra con el de 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.

6.       Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.

7.       Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37°C, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.

8.       Colocar, sucesivamente, cada una de las 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

Ejemplo:

Hoja de Trabajo

1.       ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal? Con una solución salina

2.       ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de ½? 50% de actividad

3.       ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro? Al verter la tromboplastina calcica

4.       ¿Qué se anota en el eje de ordenadas? Los segundos de cada uno